别忽视 ELISA 洗涤！这可能是实验成败的关键

ELISA检测的关键点之一是洗涤步骤。洗涤能去除未结合的酶标抗体，否则这些抗体会在后续步骤中与底物反应，产生非特异性信号，从而抬高背景值。每个步骤之间的洗涤确保只有与目标抗原特异性结合的酶标抗体被保留在微孔中，使最终的显色反应只反映目标抗原的含量。洗涤不充分会导致重复孔之间结果的变异系数增大(例如，>10%)，以及背景吸光度值显著高于空白对照(例如，>0.2)，高的背景信号会掩盖真实的信号，导致假阳性或低估目标抗原的浓度，最终影响实验结果的可靠性。  <img src="/images/upload/Image/ELISA检测基本步骤.jpg" alt="ELISA洗涤步骤" width="391" height="332" />     做ELISA实验，洗板有2种方法：手动洗板和洗板机洗板。两者没有本质区别，只要操作符合要求，就能得到正确可靠结果。<o:p></o:p>   <h3>    手动洗板<o:p></o:p></h3>       手动洗板人为因素较大，实验人员必须经验丰富，洗板次数要充足，冲击力不宜过大。洗板液加入量以刚好填满反应孔为宜，防止孔内游离酶被冲走，同时防止液体跨孔流动。洗板后擦干也非常重要，否则可能造成假阳性。每次洗板后，用吸水纸轻轻拍干。垂直握持板子，避免交叉感染。用力不宜过猛，防止抗原抗体复合物脱落；吸水纸应一次性使用，且最好使用不易脱落碎屑的吸水纸。酶结合物不耐干燥，尤其在较高温度下更容易失活。因此，拍干的反应板应尽量缩短暴露在空气中的时间，时间越长，吸光度值越低。<o:p></o:p>       手动操作有浸泡、流水冲洗两种方式：<o:p></o:p>       浸泡清洗<o:p></o:p>       1.吸干或旋转干燥孔内的反应溶液；<o:p></o:p>       2.用洗涤液清洗一次（将洗涤液注满孔内，然后倒掉）；<o:p></o:p>       3、浸泡，即将洗液注满板孔，静置1～2分钟，间歇摇晃，浸泡时间不可随意缩短；<o:p></o:p>       4.吸干孔内的液体。彻底吸干，可以使用水泵或真空泵，也可以将液体抖掉，然后用干净的毛巾或吸水纸拍干；<o:p></o:p>       5.重复步骤3和4，洗涤3至4次（或按说明书规定）。间接法中，如果背景较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。<o:p></o:p>       微量滴定板多采用浸泡洗涤法，洗涤液多为含有非离子去垢剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水的，非离子去垢剂同时含有疏水基团和亲水基团，疏水基团通过疏水键与蛋白质的疏水基团结合，从而减弱蛋白质与固相载体的结合。亲水基团与水分子结合，使蛋白质重新回到水溶液状态，从而脱离固相载体。<o:p></o:p>       洗涤液中的非离子去垢剂通常为Tween20，其浓度可在0.05%～0.2%之间，高于0.2%时可使包被在固相上的抗原或抗体解吸，降低检测灵敏度。<o:p></o:p>       流水冲洗型<o:p></o:p>       流水冲洗法最初用于清洗珠子载体，洗涤液只有蒸馏水甚至自来水。洗涤时会附加一个特殊的装置，使珠子在流水的冲击下不断翻滚冲洗。持续冲洗2分钟后，吸收液体，再在蒸馏水中浸泡2分钟，吸干。浸泡式就像浴缸，流水冲洗式就像淋浴。清洁效果更彻底，也更简便快捷。<o:p></o:p>       实验证明，流水冲洗同样适用于清洗酶标板。清洗时，尽量加大水流量或增加水压，使水流冲击到板孔表面，清洗效果会更好。<o:p></o:p>   <h3>    洗板机<o:p></o:p></h3>       洗版机洗版人为因素少，速度快，条件恒定。但是，使用洗版机洗版时应注意以下三个关键点。<o:p></o:p>       洗涤参数<o:p></o:p>       主要参数是洗涤液体积。自动洗板机分配洗涤液。如果您之前遇到过高背景，请毫不犹豫地将洗涤液体积设置为较高，最好高于包被体积。洗涤液太少会导致部分分析表面未被清洗，从而显著增加背景。所有反应孔的洗涤液体积必须相同。<o:p></o:p>       洗涤时间<o:p></o:p>       影响洗涤结果的主要参数是洗涤次数。当然，洗涤次数越多，背景越低。然而，洗涤次数过多会降低信号强度，导致难以测量。通常的做法是每次抗体或抗原孵育后重复洗涤三次。但一般来说，包被板所需的洗涤次数比用户包被板要少。对于用户包被的ELISA板，必须优化洗涤次数。<o:p></o:p>       控制洗涤量和次数的另一种方法是添加过量的洗涤液。通常，96孔板的每个孔可容纳330至460µl的洗涤液。然而，一些自动洗板机可以编程分配远高于此量的洗涤液，例如1ml。具体怎么做呢？其实很简单，只需在分配液体时打开抽吸功能即可。换句话说，当分配器分配更多液体时，抽吸器也会将液体抽出。这项技术可以提高洗涤容量，而不会将液体溅到其他孔中。<o:p></o:p>       还有一些参数会影响清洗步骤的性能。这些参数包括吸液高度和吸液位置，两者都可以调整，以减少背景（残留）和差异。<o:p></o:p>       残留液体含有未结合的抗原或抗体，可能会增加背景信号。残留量越少，剩余液体越少，转移到下一步骤的干扰液体也就越少。<o:p></o:p>       吸液高度会显著影响残留量，清洗吸头与反应孔底部距离稍大，残留量会急剧增加；反之，清洗吸头紧贴反应孔底部，也会降低吸液效率，残留量增加。<o:p></o:p>       目前洗板机通常使用两种类型的洗头：刚性和浮动。浮动洗头的吸头在清洗过程中可以自由上下移动，而刚性洗头则固定不动。使用刚性洗头的清洗操作优化起来更加复杂，因为您需要非常仔细地调整吸头高度。如果您的实验室使用多块不同的板，这可能会非常耗时。使用浮动洗头时，吸头会下降到反应孔的底部。<o:p></o:p>       吸液位置对残留量也有显著影响；如果每个孔只使用一个吸液点（由于速度更快，这种情况很常见），则需要优化吸液位置。最佳位置取决于洗头的特性，但很少位于反应孔的中间，尽管这是所有洗头最常见的默认位置。一般来说，最佳位置位于孔的中间和孔壁之间。<o:p></o:p>       反应孔的形状也会影响残留量。C形底部（平底、圆角）的微孔板的残留量通常低于平底、尖角的微孔板。<o:p></o:p>

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