产品介绍：
产品名称：埃希氏菌通用PCR检测试剂盒
英文名称：Escherichia spp.PCR
准备物品：
清理液（A） 毫升
染色液（t B） 微升
稀释液（C） 毫升
溶解液（tD） 毫升
产品说明书 1份
注意事项：
1．基础程序；
2．扩增温度和延伸温度；
3．反应时间；
4．循环次数；
5．PCR 反应液的配制；
6．PCR技术的基本原理；
7．PCR的反应动力学；
8．PCR扩增产物；
9．PCR反应体系与反应条件。
反应五要素：
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列*有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶联生物经过不断的实验优化和改进，积累了大量的经验，拥有专业的酶联研发团队。利用专业的酶联免疫技术自主研发的elisa试剂盒，能对血清及其它样本定量检测抗原，定性检测特异性抗体。优质的试剂，先进的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA检测的方便性、稳定性、重复性和可靠性方面都具有很大的优势。
ELISA检测技术服务内容：
1、双抗体夹心法检测抗原 2、间接法检测抗体 3、为客户提供各种ELISA技术进行样本检测。
以上代测费，凡购买本公司试剂盒，我们免费代测！
凡购买本公司目录任何一种酶联免疫检测试剂盒，您只需将需要检测的动物（Human, Rat, Mouse, Rabbit, Monkey,
Pig……）种类和检测指标（白介素类、激素类）及标本数量（48T/96T）通知公司业务员即可。在接到客户标本当日起，现货产品一周内将检测报告交到客户手中！
欢迎各科研单位在各种项目上与我们公司开展不同层次的密切合作，以双赢求发展，共同进步，为中国检测事业的发展积累经验。
二、样本要求
在收集标本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。我们提倡新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，请造模取材后，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以避免反复冻融。代测放免标本的客户取材前须向我司销售人员索要说明书，具体操作注意事项请与我司技术人员沟通。
液体类标本：标本必须为液体，不含沉淀。包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。
血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
血浆：应根据试剂盒的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，加入10%（v/v）抗凝剂(0.1M柠檬酸钠或1%heparin
或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
尿液、胸腹水、脑脊液：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.0-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，缓冲液中可加入1μg/L蛋白酶抑制剂或50U/ml的Aprotinin（抑肽酶）。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清置于-20度或-70度保存，如有必要，可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
三、寄标本时需注明以下情况：
1、标本编号；2、所测项目；3、是否做复孔；3、联系方式；4、实验后标本是否寄回。
客户须知：
客户应对所提供的材料及信息负责，如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。
PCR试剂盒成功的重要要素及注意事项
模板降解
1. 尽量选择新鲜提取的模板进行 PCR 扩增，通过凝胶电泳检测模板的完整性，若降解严重需要重新制备模板。
2. 模板避免反复冻融。
模板中含有抑制 DNA 聚合酶活性的抑制剂
1. 采用离心柱法提取核酸，纯化模板，消除抑制剂的干扰。
2. 适当减少模板量，采用梯度稀释摸索最佳模板量。
3. 选用抗逆性强的 DNA 聚合酶。
模板量太低
1. 适当增加模板量。
2. 模板为 cDNA 时，选用目的基因表达量高的组织提取高质量 RNA 并选用基因克隆专用的反转录试剂盒得到的 cDNA 作为模板。
3. 选用灵敏度高的 DNA 聚合酶。
高GC, 复杂模板
1. 使用 PCR 添加剂（比如 DMSO，甜菜碱）或 GC enhancer，促进高 GC，复杂序列模板双链解离从而有利于引物退火和序列延伸。
2. 增加变性时间或温度，使 DNA 双链彻底解离。
3. 选用适用于高 GC，复杂模板扩增的 DNA 聚合酶。
长片段
1. 确保模板的完整性。
2. 选择适用于长片段扩增的 Taq DNA 聚合酶或者超强高保真 DNA 聚合酶。
3. 在试剂盒说明书建议的延伸速度基础上适当延长延伸时间。
4. 采用抑制热交错 PCR（Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR）策略。
引物降解
重新合成高质量引物，少量分装保存，防止多次冻融，避免长期置于冰箱冷藏部分。
引物设计不合理
1. 建议使用引物设计软件（比如Primer premier 6, Oligo 7等）设计并选取评分较高的引物。
2. 确保引物和模板结合的特异性。
DNA 聚合酶及其他反应组分
1. DNA 聚合酶选择不合适
2. 根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶，比如分子克隆实验中涉及到序列的高保真扩增，需要选择一款针对不同类型序列具有普适性的高保真酶。
DNA 聚合酶活力下降
检查试剂是否过期，按照说明书要求合理保存试剂。
反应缓冲液体系与目的基因不匹配
不同目的 PCR 反应要求反应缓冲液中的镁离子、钾离子、铵离子、化学添加剂等成分浓度是不一样的，建议使用试剂盒中优化好的缓冲液体系。
反应条件
退火温度不合适，影响引物与模板特异结合
1. 使用引物设计软件建议的退火温度，退火温度一般比引物的 Tm 值低 5 ℃。
2. 不同的试剂盐离子浓度不同，最佳的退火温度可能存在差异，建议以软件建议退火温度为中心设置温度梯度，来获得最佳退火温度。
3. 设置降落 PCR（Step-down）反应程序。
其他反应条件不合适
不同的 DNA 聚合酶试剂最佳反应条件是有差别的，选用试剂说明书建议的变性温度和时间，退火时间，延伸温度和速度，循环数。
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