检测原理
:
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被
大鼠Ki-67蛋白(Ki-67)止抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入
大鼠Ki-67蛋白(Ki-67)
校准品和待测样本，再加入另一株
HRP标记的抗
大鼠Ki-67蛋白(Ki-67)
（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体
-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物 A和 B，底物在 HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪
450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中
大鼠Ki-67蛋白(Ki-67)的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中
大鼠ELISA试剂盒Ki-67的浓度。
所需器材和试剂
1、
酶标仪
(波长 450nm 滤光片)
2、37°C 恒温箱(不推荐使用细胞用 CO2 培养箱)
3、
自动洗板机或多道移液器
/5ml 滴管(手工洗板用)
4、
无菌的
EP 管及一次性吸头
5、
精密的单道
(0.5-10μL, 5-50μL, 20-200μL, 200-1000μL)和多通道移液器(移液器使用前需校准)。
6、吸水纸及加样槽
7、去离子水或蒸馏水
试剂盒组成：
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名称
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48Ｔ
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96Ｔ
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抗体预包被酶标板
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8×6
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8×12
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冻干标准品
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0.5 ng/支×2支
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0.5 ng/支×3支
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标准品
&标本通用稀释液
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12ml×1瓶
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20ml×1瓶
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浓缩生物素化抗体
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1支(规格见标签）
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1支(规格见标签）
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生物素化抗体稀释液
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10ml×1瓶
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16ml×1瓶
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浓缩酶结合物
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1支(规格见标签）
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1支(规格见标签）
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酶结合物稀释液
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10ml×1瓶
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16ml×1瓶
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浓缩洗涤液
20×
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25ml×1瓶
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50ml×1瓶
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显色底物(TMB)
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6ml×1瓶
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12ml×1瓶
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反应终止液具腐蚀性
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6ml×1瓶
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12ml×1瓶
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封板胶纸
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3张
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6张
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产品说明书
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1份
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1份
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标本收集
:
1、收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2、
血浆抗凝剂推荐使用
EDTA 。避免使用溶血，高血脂标本。
3、标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4、
标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于
-20 ℃ , -70 ℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。
5、
如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，
做适当倍数稀释
(建议做预实验，以确定稀释倍数)。
储存条件：
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未开封完整试剂盒
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4℃保存，请在保质期内使用
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已封完整试剂盒
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抗体包被板条
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未用完的板条放回带拉链铝箔袋，封好口
4℃条件下可储存1个月左右
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标准品
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冻干粉
-20℃可储存6 个月左右，
稀释后的标准品使用后请丢弃
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浓缩生物素化抗体
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浓缩液
4℃可储存1个月左右，
释后即用即弃
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浓缩酶结合物(避光)
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标准品＆标本通用稀释液
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4℃条件下，可储存1 个月左右
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生物素化抗体稀释液
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酶结合物稀释液
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显色底物(避光)
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反应终止液
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浓缩洗涤液
20×
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样品采集及保存：
1、
血清全血样本室温放置
2小时或 2-8°C 过夜。1000×g 离心20分钟，取上清。可立即检测，或按一次使用量分装冻存于-20°C 或-80°C。
2、
血浆抗凝剂推荐使用
EDTA-Na2/K2，样品采集后30分钟内于2-8°C，1000×g 离心15分钟，取上清。可立即检测，或按一次使用量分装冻存于-20°C
或-80°C。其他抗凝剂的使用及选择请查看样品制备指南。
3、组织样本组织样本一般制成组织匀浆，处理方法如下：
3.1、
将目标组织置于冰上，用预冷的
PBS缓冲液(0.01M，pH=7.4)洗涤去除残留的血液，称重后备用。
3.2、
在冰上用裂解液研磨组织匀浆。加入裂解液的体积取决于组织的重量，一般情况每
1g 组织碎片使用9ml裂解液。另外建议在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如 1mM PMSF。
3.3、
可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理
(超声破碎过程中，需冰浴降温；反复冻融法可重复2次)。
3.4、
将制备好的匀浆液于
5000×g 离心 5 分钟，留取上清即可检测。或按一次使用量分装冻存于-20°C 或-80°C。
3.5、
根据实验需要，组织匀浆样本可先测定总蛋白浓度
,以便于数据分析，推荐 BCA 法。一般调整总蛋白浓度至 1-3mg/ml 用于 ELISA 检测。某些组织样本，如肝脏，肾脏，胰腺因含有较高浓度的内源性过氧物酶,
在样品浓度较高的情况下会和显色底物反应，出现假阳性。可尝试使用 1%H2O2 灭活 15min 再检测。
注意：
裂解液常用
PBS 缓冲液，或使用中等强度 RIPA 裂解液。使用 时，PH 值需调整为PH7.3，避免使用含 NP-40，Triton X-100 和 DTT
的组分，会严重抑制试剂盒工作。推荐使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH 7.3，可自行配制或联系我们购买。
4、
细胞培养上清收集上清液，
2-8°C，2500rpm 离心 5min，收集澄清的细胞培养上清。立即用于检测，或按一次使用量分装于-80°C 冻存备用。
5、细胞裂解液
5.1、
悬浮细胞的收集及裂解：
2-8°C，2500rpm 离心 5min，收集细胞。再加入预冷的 PBS 轻轻混匀清洗，2-8°C，2500rpm 离心 5min，收集细胞。加入 0.5-1ml
细胞裂解液及适量蛋白酶抑制剂(如 PMSF，工作浓度 1mmol/L)，置于冰上，裂解 30min-1h , 或者配合超声波破碎。
5.2、
贴壁细胞的收集及裂解：吸走上清液，加入预冷的
PBS 洗三次。加入 0.5-1ml 细胞裂解液及适量蛋白酶抑制剂(如PMSF，工作浓度 1mmol/L)，用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞。细胞悬液转入离心管中，置于冰上，裂解
30min-1h，或者配合超声波破碎。
5.3、
细胞裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，使蛋白充分裂解
, 出现黏糊状是 DNA，可以使用超声波破碎DNA。(或用超声波 3-5mm 探头，功率 150-300W, 冰上超声处理样品，工作 1-2 秒，停止 30 秒， 3~5 个循环。)
5.4、
裂解或超声破碎完成，
2-8°C，10000rpm 离心 10min，上清移入 EP 管中，立即用于检测，或按一次使用量分装于-80°C 冻存备用。
注意：注意事项同组织样本。
6、
其他生物样本
2-8°C，1000×g 离心样品 20 分钟。收集上清液立即用于检测，或按 一次使用量分装于-80°C 冻存备用。
操作步骤：
步骤
1：
向孔中加入
100ul 标准品或待测样品，贴上覆膜， 37°C 静置孵育 90 分钟。
洗板：
洗板
2 次。不浸泡。
步骤
2：
加入
100ul 生物素-抗体工作液，贴上覆膜， 37°C 静置孵育 60 分钟。
洗板：
洗板
3 次。每次浸泡 1 分钟。
步骤
3：
加入
100ul HRP-链霉亲和素(SABC)工作液，贴上覆膜，37°C 静置孵育 30 分钟。
洗板：
洗板
5 次。每次浸泡 1 分钟。
步骤
4：
添加
90ul TMB 显色底物。贴上覆膜， 37°C 静置孵育 10-20 分钟(请使用 TMB 显色精准控制方法)。
步骤
5：
添加
50ul 反应终止液。立即在 450nm 处读取 OD450 值并计算。
注意事项：
1、使用不同的试剂盒时，需先做好标记，防止组分混用，导致实验失败。
2、
试剂盒开启后，酶标板和标准品的保存条件请参考组件保存条件表格
(受潮后活性会下降)。如发生使用或保存不当
导致组件缺损，可申请购买配套组件
(如 E002 冻干标准品)。
3、请使用无菌一次性吸头吸取试剂，使用后，须旋紧试剂瓶盖，以防止微生物污染和蒸发。
4、手工洗板时，加洗液的吸头或滴管，切勿接触酶标板孔。不充分的洗涤或污染容易造成假阳性和高背景。
5、检测过程中，请提前准备好下一步实验所需试剂，洗板后及时将试剂加入板孔，防止板孔干燥，导致检测失效。
6、在未经确认的情况下，请勿将其他批次试剂盒的试剂或其他来源的试剂用于本试剂盒。
7、请勿重复使用一次性吸头，以免造成交叉污染。
8、加样完成，贴覆膜以防孵育过程样品的蒸发，在推荐温度下完成孵育过程。
9、试验中请穿实验服、戴口罩、手套等，做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品时，请按生物试验室安全防护条例执行。
总结：感谢您选用本公司ELISA系列产品。本产品可检测血清、血浆、细胞培养上清液、灌洗液、尿液、羊水、腹水、脑脊液、胸腔积液、组织匀浆液等多种类型样本大鼠ELISA试剂盒Ki-67浓度，具体适用样本请咨询本商铺。
酶联生物经过不断的实验优化和改进，积累了大量的经验，拥有专业的酶联研发团队。利用专业的酶联免疫技术自主研发的elisa试剂盒，能对血清及其它样本定量检测抗原，定性检测特异性抗体。优质的试剂，先进的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。ELISA检测的方便性、稳定性、重复性和可靠性方面都具有很大的优势。
ELISA检测技术服务内容：
1、双抗体夹心法检测抗原 2、间接法检测抗体 3、为客户提供各种ELISA技术进行样本检测。
以上代测费，凡购买本公司试剂盒，我们免费代测！
凡购买本公司目录任何一种酶联免疫检测试剂盒，您只需将需要检测的动物（Human, Rat, Mouse, Rabbit, Monkey,
Pig……）种类和检测指标（白介素类、激素类）及标本数量（48T/96T）通知公司业务员即可。在接到客户标本当日起，现货产品一周内将检测报告交到客户手中！
欢迎各科研单位在各种项目上与我们公司开展不同层次的密切合作，以双赢求发展，共同进步，为中国检测事业的发展积累经验。
二、样本要求
在收集标本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。我们提倡新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，请造模取材后，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以避免反复冻融。代测放免标本的客户取材前须向我司销售人员索要说明书，具体操作注意事项请与我司技术人员沟通。
液体类标本：标本必须为液体，不含沉淀。包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。
血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
血浆：应根据试剂盒的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，加入10%（v/v）抗凝剂(0.1M柠檬酸钠或1%heparin
或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
尿液、胸腹水、脑脊液：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。
细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.0-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，缓冲液中可加入1μg/L蛋白酶抑制剂或50U/ml的Aprotinin（抑肽酶）。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清置于-20度或-70度保存，如有必要，可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
三、寄标本时需注明以下情况：
1、标本编号；2、所测项目；3、是否做复孔；3、联系方式；4、实验后标本是否寄回。
客户须知：
客户应对所提供的材料及信息负责，如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担。
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